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产品说明：

使用说明：

建议工作浓度

1）大肠杆菌筛选：25-50μg/mL（低盐LB培养基，NaCl浓度不能超过5g/L）

2）酵母菌筛选：50-300μg/mL（YPD或基本培养基）

3）哺乳动物细胞筛选：50-1000μg/mL（合适培养基，根据细胞系而不同）

操作步骤

一、建立杀灭曲线

1. 重新铺板或者将满盘细胞重新分盘，使得细胞密度约25%，按照8个平板/组准备，培养24 h。

2. 去除旧培养基。加入含不同浓度博来霉素的筛选用培养基，博来霉素浓度可设置为0，50，100，200，400，600，800和1000 μg/mL，每个浓度做3个平行；也可根据自身实验体系，设置不同的浓度梯度。

3. 每3-4天更换新鲜的筛选培养基，并观察存活细胞的比例。选择在合适的时间（1-2周内）杀死大多数细胞的浓度为最佳工作浓度。

【注】：若是难以在显微观察下区分活细胞，也可用台盼蓝染色来计算存活细胞的数量，以确定博来霉素的最适浓度。

二、筛选稳定转染细胞

1. 转染细胞，用100 mm培养皿进行培养。以未转染的细胞作为阴性对照。

2. 转染后，用预热的1× PBS洗涤一次，加入新鲜培养基。
3. 转染48-72 h后，用含有最佳浓度博来霉素（由灭杀曲线确定）的新鲜培养基筛选细胞。为了更好的鉴定和筛选细胞集落，建议将细胞按比例稀释成一系列浓度。
【注】：若待筛选细胞对博来霉素的抗性明显强于大部分细胞，或者细胞快速分裂导致低浓度情况博来霉素的筛选效果不明显，按照以下方法克服此类耐性：

a）将细胞直接用含博来霉素的筛选培养基进行分盘；

b）37℃孵育2-3 h直至细胞贴壁；

c）从培养箱内取出细胞并于4℃放置2 h，一定要确保培养基内含有HEPES。【此步的目的在于短时间内终止细胞分裂活动，从而允许博来霉素抗性得以发挥，杀死细胞。】

d）细胞重新放回37℃培养箱内培养。

4. 每3-4天加入选择培养基，直到出现细胞集落。

5. 挑选并转移克隆到96或48孔板中。在进行更大孔径培养板或培养皿上扩大培养之前，确保培养细胞密度近100%。

三、维持培养稳定转染细胞

可采取以下方式维持培养稳定转染细胞：

a）使用含相同剂量博来霉素的筛选培养基来维持培养；

b)  降低博来霉素剂量为原来的一半进行维持培养；

c）使用正好能预防敏感细胞生长但不足以致死的博来霉素剂量来维持培养【参考杀灭曲线】。

注意事项：

1）Zeocin™对光敏感，需将抗生素，或含该抗生素的平板或培养基置于黑暗处。

2）降低培养基的盐浓度，调整pH到7.5使其保持活性，因高离子强度和酸或碱性都会抑制Zeocin™活性。

3）储存Zeocin™在-30°C~-10°C，使用前需冰上融化。

4）Zeocin™有毒，操作时需注意防护，切勿与身体或皮肤直接接触。

5）为了您的健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

本产品仅供科研使用，不可用于临床诊断应用或其他用途。