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产品描述：

Calcein Blue, AM本身仅呈微弱荧光(Ex/Em~322/435nm) ,具有细胞膜渗透性。一旦进入细胞后，被细胞内酯酶水解为钙黄绿素蓝(Calcein Blue) , 探针极性增强并能保留在细胞内数小时，此时荧光强度增强且荧光光谱迁移到更长波长(Ex/Em~360/445nm)， 光谱特征类似于DAPI. Hoechst 3342或Hoechst 33258。

使用说明：

一、储存液制备

储存液配制范围可为1 ~ 5 mM,具体根据工作浓度来决定，建议提前配制成1000x储存液。若使用的工作液为5μM,那么可配制5mM的储存液，即往1mg CalceinBlue, AM (Mw: 465.41) 内加入430μl细胞培养级别的DMSO  , 充分溶解，混匀。储存液根据单次用量分装20°C保存，避免反复冻融，数月稳定(不要超过6个月)。

二、20% Pluronic F-127制备[可选]

称取100mg Pluronic F-127粉末中加入500μl DMSO,配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解过程需要在40- 50C加热20-30min。溶液室温保存，不用冷藏。如有结晶析出，可以重新加热后溶解，不影响使用。

三、染色步骤

大多数实验体系中Calcein Blue, AM的工作浓度为2-5μM。由于不同细胞系的最佳染色条件不同，初次实验建议做梯度实验,以确定Calcein Blue, AM的最佳工作浓度，以最低的探针浓度得到最好的荧光结果为筛选原则。

1) 取一管适量分装的储存液(1000x) 置于室温，至少回温20min,低速离心后，用合适的缓冲液如PBS, HBSS-HEPES稀释到1 x染色工作液。

[注意] :有时可添加一定量的非离子表面活性剂如Pluronic F127到Calcein Blue, AM储存液内来增强其水溶性。制备染色工作液前，取一管Calcein Blue, AM储存液内加入等体积的20% Pluronic F127,使Pluronic F127的终浓度为0.02%。加入Pluronic F127的Calcein Blue, AM溶液不可长期保存，需现配现用。

2) 对于贴壁细胞，先用胰酶EDTA或Accutase消化细胞， 离心收集细胞(1000 rpm, 3min)。对于悬浮细胞，直接离心收集细胞。 [注意] :贴壁细胞也可进行原位染色。

3) 去上清，用PBS (或者其他缓冲液)清洗细胞2~3次，以充分去除残留的酷酶活性。

4) 用1/10细胞培养基体积的Calcein Blue, AM染色工作液重悬细胞，37℃孵育20min~1h。

[注意] : 1)若细胞自身含有机阴离子转运体，需加入丙磺舒(1-2.5mM)或者苯磺唑酮(0.1-0.25mM) 到孵育体系内以降低去酷化的Calcein Blue泄露到胞外;2)降低探针加载温度，可能会减少探针区室化现象。

5) 用PBS (或者其他缓冲液)洗涤细胞两次去除多余染料。

[注意] :如有必要，使用含有机阴离子转运抑制剂的缓中液来进行细胞清洗。

6）用含合适滤光片(Ex/Em= 360/445nm) 的仪器进行检测。

注意事项：

1）荧光染料均存在淬灭问题，请尽星注意避光，以减缓荧光淬灭。

2）乙酰氧基甲基酯(AM)易吸潮，冰箱取出后请在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂微量，开封前请将其短暂离心，以保证粉末落入管底。

3）Calcein Blue, AM对湿度非常敏感，粉末保存一定要保持干燥。 Calcein Blue, AM储存液需要分装避光冻存，且必须紧紧密封盖子，干燥保存。Calcein Blue,AM工作液必须现配现用。

4）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一 次性手套操作。

本产品仅供科研使用，不可用于临床诊断应用或其他用途。