订购信息：

产品说明：

使用说明：

产品描述：

Fluo-8，是目前最亮的可见光激发波长Ca2+荧光探针,其荧光强度比Fluo-4强两倍，比Fluo-3强四倍。Fluo-8具中等程度的Ca2+亲和力，几乎接近Fluo-3，Fluo-4 (Fluo-3: Kd=0.4μM. Fluo-4: Kd=0.36μM、Fluo-4: Kd= 0.389μM)，使用上几乎同Fluo-3和Fluo-4。

Fluo-8不仅维持Fluo-3，Fluo-4便捷的光谱检测特性，与Ca2+结合后的最大激发波长为490nm, 最大发射波长为514nm。而且具有改善的细胞载入和Ca2+响应能力。Fluo-8加载具较弱的温度依赖性，在室温或37°C孵育皆染色良好，不像Fluo-3, Fluo-4严格要求在37℃孵育， 此特征使其更适用于HTS高通量筛选实验。Fluo-8应用广泛，与许多细胞系和靶向样本兼容，不会受配体或靶标本身信号干扰。Fluo-8可通过激光共聚焦显微镜流式细胞仪、荧光酶标仪。荧光显微镜等来检测胞内钙离子水平的变化。

Fluo-8, AM是Fluo-8的一种乙酰甲酯衍生物，具有细胞膜渗透性，只需简单培养，即可轻易进入细胞。一旦进入细胞内，即被其内酯酶剪切生成不具膜渗透性的Fluo-8,从而滞留在细胞内以发挥相应生理功能。本品以50μg小包装的冻干粉形式供货，用于细胞内Ca2+水平检测时，常用浓度为1-5μM。

操作说明：

一.使用钙指示剂AM Esters加载细胞：

     AM酯是非极性酯，其易于穿过活细胞膜，并且通过活细胞内的细胞酯酶快速水解。 AM酯广泛用于非侵入性地将各种极性荧光探针装载到活细胞中。 但是，使用AM酯时必须小心，因为它们易于水解，特别是在溶液中。 它们应在使用前用高质量的无水二甲基亚砜（DMSO）重新配制。 DMSO储备溶液应在-20°C下干燥储存并避光。 在这些条件下，AM酯应稳定数月。

     以下是我们推荐的将AM酯加载到活细胞中的方案。该方案仅提供指南，实际情况应根据您的具体需求进行修改。

a）在高质量无水DMSO中制备2至5 mM AM酯原液。

b）在实验当天，将钙指示剂溶解在DMSO中或将等份的指示剂储备溶液解冻至室温。使用0.02％Pluronic®F-127在您选择的缓冲液（如Hanks和Hepes缓冲液）中制备1至10μM的工作溶液。对于大多数细胞系，我们建议钙指示剂的最终浓度为4-5 uM。 细胞加载所需指标的确切浓度必须根据经验确定。 为避免因过载和潜在染料毒性引起的任何伪影，建议使用可产生足够信号强度的最小探针浓度。

注意：非离子洗涤剂Pluronic®F-127有时用于增加钙指示剂AM酯的水溶性。

c）如果您的细胞含有有机阴离子转运蛋白，可以在细胞培养基中加入丙磺舒（1-2.5 mM）或磺吡酮（0.1-0.25 mM），以减少脱酯化指标的泄漏。 在室温或37°C下用钙指示剂酯孵育细胞20分钟至1小时。

d）在HHBS或您选择的缓冲液（含有阴离子转运蛋白抑制剂，如2.5mM丙磺舒，如果适用）中洗涤细胞1-2次以除去过量的探针。

e）在所需的Ex / Em波长下进行实验。

二.测量细胞内钙响应：

     为了确定溶液的游离钙浓度或单波长钙指示剂的Kd，使用以下等式：[Ca]free = Kd[F - Fmin]/Fmax - F]

     其中F是实验钙水平下指示剂的荧光，Fmin是不存在钙时的荧光，Fmax是钙饱和探针的荧光。 解离常数（Kd）是探针对钙的亲和力的量度。 与校准溶液相比，荧光指示剂的Ca2 +结合和光谱性质在细胞环境中变化非常显着。 细胞内指标的原位校准通常产生显着高于体外测定的Kd值。 通过在离子载体如A-23187,4-溴A-23187和离子霉素存在下将加载的细胞暴露于受控的Ca 2+缓冲液来进行原位校准。 或者，细胞透化剂如洋地黄皂苷或X-100可用于将指示剂暴露于细胞外培养基的受控Ca2 +水平。

注意事项：

为了您的安全和健康，请穿实验服并带一次性手套操作。

本产品仅供科研使用，不可用于临床诊断应用或其他用途。