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使用说明：

基本描述:

CFDA，SE是一种稳定的、细胞膜渗透性的非荧光染料，由两个醋酸基团和一个琥珀酰亚胺酯(SE) 官能团组成的一个荧光分子。一旦主动扩散进入细胞，其醋酸基团被胞内酯酶切割，生成荧光素酯CFSE。CFSE具有高度荧光，且能通过其琥珀酰亚胺酯基团共价结合到细胞内的蛋白氨基基团。正是这个共价偶联反应，CFSE能够极其长期的保留在细胞内，长达数个月。

另外，归因于这一稳定连接,一旦染料进入细胞， 不会转移到邻近细胞。无活力细胞仍然是非荧光。而活细胞一旦分化，CFSE能够很均匀的分散到子细胞中，每分裂一次子代细胞约能得到亲本细胞1/2的荧光强度，因此，通过流式细胞仪对荧光强度的检测，能够依次分选出未分裂细胞，分裂一次的细胞(1/2荧光强度)，分裂两次的细胞(1/4荧光强度)，分裂三次的细胞(1/8荧光强度) , 以及以此类推其他分裂次数的细胞。CFSE可以检测分裂多达8次或更多次数的细胞增殖。

使用方法
一.  储存液制备

将低温保存的冻干粉产品置于室温回温至少20min,之后短暂低速离心，让所有粉末都掉落至管底。称取适量粉末用高质量无水DMSO溶解配制10mM储存液。比如5mg CFDA, SE (Mw: 557.46)用897μl DMSO充分溶解即得到10mM储存液。根据单次用量分装，置于≤-20°C避光干燥保存， 避免反复冻融。储存液最好是一个月内用完，最多不超过三个月。

二.工作液制备

于正式实验前，用HHBS缓冲液或其他生理缓冲液(pH 7.0)稀释储存液到1-10μM工作浓度，涡旋混匀。

[注意事项] :

1 CFDA, SE是胺反应性。CFDA, SE标记步骤不可使用含首胺的缓冲液，比如，HHBS或PBS是推荐的CFDA, SE稀释缓冲液。

2 CFDA, SE的染色浓度需要根据使用的细胞类型和实验目的来进行优化调整。比如，如果用于细胞增殖的荧光逐渐稀释分析,相对高浓度的CFDA, SE染色工作液比较理想；如果仅是用来标记细胞用作另外一种荧光标志探针的复染剂，相对低浓度的CFDA, SE染色工作液比较理想，能够良好的防止不同滤片设置间的荧光溢出。

三. 染色步骤

3.1室温300 xg离心细胞5min,吸掉上清。

3.2用预热的无菌HHBS. PBS或其他生理缓冲液清洗细胞以去除任何残留的血清蛋白。之后同上离心细胞，吸掉上清。

3.3用上述配制好的CFDA, SE染色工作液重新悬浮细胞，制备成1-3 x 107cells/mL的单细胞悬液。

3.4室温或37℃避光孵育15~ 30min。中间可偶尔的轻轻颠倒混匀使得细胞均匀接触到染料。

3.5加入5倍原始染色体积的细胞培养液(含10% FBS)来淬灭染色过程，轻轻颠倒几次混匀。

3.6室温300 xg离心细胞5min,吸掉上清。再用10ml完全细胞培养液清洗细胞一次。

3.7再用10ml完全细胞培养液重新悬浮细胞，37℃解育5min, 以促进CFDA, SE在细胞内的充分反应和未反应的CFDA, SE重新回到完全细胞培养液中。离心去上清，完成最后一次清洗。

3.8之后用完全细胞液重悬细胞，此时可用荧光显微镜或流式细胞仪来观察标记效果。或开始用药物刺激处理或继续常规培养。经适当时间后用流式细胞仪检测细胞增殖，或用于特定目的的细胞示踪。标记细胞也可用于活体动物的移植，并用荧光进行示踪。

注意事项：

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

本产品仅供科研使用，不可用于临床诊断应用或其他用途。