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产品说明：

胶原蛋白是结缔组织和内脏器官细胞外基质的主要构造成分，但在皮肤、肌腱、骨骼中分布最为广泛。从遗传和结构上胶原蛋白分为许多类型。胶原蛋白 I (Collagen,Type I)是由2个α1链和1个α2链组成的异源多聚体，在37°C， 中性pH下自发形成三螺旋骨架，是一种优秀的细胞培养用基质，广泛用于肝细胞、成纤维细胞、脊神经节、肌肉细胞、施万细胞、胚肺细胞、上皮细胞和其他大量细胞系。 还能用于研究细胞生长、分化、迁移以及发育过程中的组织形态发生。

我司提供的鼠尾胶原蛋白l是根据Birkedal-Hansen方法，通过醋酸抽提、氯化钠沉淀、磷酸氢二钠沉淀等步骤制备。可用于包被细胞培养器皿，培养细胞表面粘附性，特别适合那些在普通培养器皿表面不易贴壁的细胞，比如成纤维细胞、肝细胞等原代细胞。还可用于三维胶的制备，模拟真实的生长环境，使得细胞在三维环境中生长。

本品为溶于6mM HAc的无菌溶液，浓度5mg/ml, 每个批次产品皆通过细胞培养测试(包括三维空间培养)以保证质量的可靠性。

保存：2-8℃保存，不可冻存，有效期一年

运输：冰袋运输

使用说明：

一.细胞培养器皿的表面包被

组织培养器皿的表面包被推荐浓度为1-5μg/cm2，起始浓度可首选5μg/cm2.建议根据具体细胞类型来优化。

1.1 6mM HAc稀释液的制备

本品以溶于6mM HAc (=0.36g/L HAc) 的无菌溶液形式提供，本身不溶于中性pH,建议用6mM HAc溶液做进一步稀释。

配制方法:取34.5ul冰醋酸 (17.4 M)加入100ml双蒸水,充分混匀后即得到6mM HAc溶液，0.22um滤膜过滤除菌后待用。

1.2包被步骤

A.根据自身实验体系以及优化后的包被浓度来计算所需的胶原蛋白量，并加入相应孔内，确保胶原蛋白溶液完全覆盖表面。

1) 以包被浓度为5μg/cm2,先用6mM HAc稀释液将胶原蛋白(5mg/ml) 稀释到合适的中间浓度，如50μg/ml, 然后参考表1不同培养皿内胶原蛋白加量表来加量到各孔内;

2)以包被浓度为2ug/cm2,先用6mM HAc稀释液将胶原蛋白(5mg/ml)稀释到合适的中间浓度，如12ug/ml, 然后参考表1不同培养皿内胶原蛋白加量表来加量到各孔内:

表1：不同培养皿内胶原蛋白加量表

B.室温孵育1h,小心吸掉多余液体，用无菌PBS清洗3~4次后直接使用。或者加完胶原蛋白溶液后，在超净台内开盖过夜晾干。无菌条件下，包被好的器皿在4-25℃至少可保存3个月。

二. 三维胶原的制备
    当鼠尾胶原蛋白I使用浓度> 1mg/ml, pH 7.0左右皆可形成具有一定强度的三维胶，建议成胶浓度为1-2 mg/ml.
    由于本品是以溶于6mM HAc的无菌溶液形式提供，在成胶过程需先加入0.06倍体积的0.1M NaOH中和。

2.1需要溶液准备(无菌、 预冷)
10xPBS (可含酚红)或10x细胞培养液
0.1M NaOH
双蒸水

2.2三维胶原制备(不含细胞) (以配制1ml, 1mg/ml三 维胶为例) :
a，取200μl胶原蛋白 (5mg/ml) 加到置于冰浴的离心管内，加入690uI无菌水。之后加到12μl 0.1M NaOH [注意:该步骤不能反，如果反过来把12μl 0.1M NaOH加到胶原溶液中，会由于NaOH不能迅速混匀而产生局部的胶原凝结] , 立即混匀。再加入100μl 10xPBS或10x细胞培养液，混匀后立即加到培养器皿中[注意:混匀后pH为7.0左右，如果PBS或培养液中没有加酚红，初次使用时需要用pH试纸测试]

b，将培养器皿在室温(25°C左右) 放置20min待胶凝固后，转移到培养箱内。[注意] : 如果配制中使用的是10xPBS,需要在做细胞培养前，先加入适当体积的细胞培养液预平衡。

2.3三维胶原制备(含细胞) (以配制1ml, 1mg/ml三 维胶为例) :

a,准备好细胞悬液,并放置于冰浴中。
b，将200μl胶原蛋白(5mg/ml) 加到12μl 0.1M NaOH [注意:该步骤不能反，如果反过来把12ul 0.1M NaOH加到胶原溶液中，会由于NaOH不能迅速混匀而产生局部的胶原凝结]，立即混匀。再加入23μl 10xPBS或者10x细胞培养液，立即混匀[注意:混匀后pH为7.0左右，如果PBS或培养液中没有加酚红，初次使用时需要用pH试纸测试]。再加入760μl的细胞悬浮液,混匀后立即加到培养器皿中。
c，将培养器皿在室温(25°C左右) 放置20min待胶凝固后，加入适当体积细胞培养液，转移到培养箱中培养。

注意事项：

1、整个操作请于冰上进行，因室温鼠尾胶原可迅速成胶，操作过程尽量保持低温。

2、整个操作请在无莹环境下无莹操作，避免污染以影响细胞生长。

3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作

本产品仅供科研使用，不可用于临床诊断应用或其他用途。