订购信息：
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目录号 |
产品名称 |
规格 |
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X11461 |
X-Gluc 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸环己胺盐 |
100mg |
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X11462 |
X-Gluc 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸环己胺盐 |
1g |
产品说明：
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CAS号 |
114162-64-0 |
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分子式 |
C14H13BrClNO7.C6H13N |
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分子量 |
521.79g/mol |
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纯度 |
＞99%(By HPLC) |
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外观 |
白色至类白色结晶粉末 |
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溶解性 |
DMF和甲醇 |
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运输 |
冰袋运输 |
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保存 |
-20℃保存，5年有效 |
作用机制:
X-Gluc，也称为5- Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide (5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸)， 是β-葡萄糖苷酶 (β-glucuronidase, GUS)的显色底物，由一种广泛使用的报告基因gusA (uidA) 所编码。GUS水解X-Gluc, 生成一种无色的葡萄糖醛酸和一种肉眼可见的氯-溴靛蓝(chloro-bromoindigo) 深蓝色沉淀。利用这一特性, X-Gluc常 用来检测植物细胞和组织中的GUS表达;另外, X-Gluc还能用来检测大肠杆菌引起的感染状况;或检测食物或水源是否受细菌污染。
主要应用：转基因植物报告基因GUS活性检测，X-gluc用作显色底物。
普遍应用优势在于：绝大多数植物细胞内不存在内源性的GUS活性,而且GUS基因表达产物具有检测方法简单、灵敏度高，易于定量及定性分析，能够与其他蛋白质基因融合等优势，因此，GUS基因为植物工程研究中应用最广泛的报告基因(报道基因)之一。
1. GUS活性检测(组织化学定位法,定性研究)
GUS催化底物X-gluc在酶活性位点生成深蓝色沉淀，为研究外源基因在植物中表达具体部位研究提供很好的研究手段。且GUS酶和显色产物非常稳定，植物中可以积累。
1.1 GUS染色液制备[作为参考，可按照具体实验条件来调整]
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试剂名称 |
配置方法 |
用量 |
备注说明 |
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X-Gluc储存液 |
溶解1mg X-gluc于0.1ml甲醇, 低速旋涡充分溶解 |
100ul |
最早实验使用DMF作为X-gluc溶剂，但是有研究发现DMF会抑制GUS活性，使用甲醇作为溶剂可将GUS活性提高25% |
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2 x buffer |
磷酸盐缓冲液 PH7.0(0.1 M NaH2PO4/0.1 M Na2HPO4)； |
1ml |
体外X-gluc活性(荧光定量染色)显示，使用柠檬酸盐酸溶液可将GUS活性提高20%。 |
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0.1 M potassium |
将4.2239g亚铁氰化钾溶于水，定容至100ml |
20ul |
亚铁-/铁氨化钾的最佳工作浓度需要摸索，建议最好起始工作浓度为1 mM. |
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0.1 M potassium |
将3.2924g铁氰化钾溶于水，定容至100ml。 |
20ul |
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10% Triton X-100 |
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10ul |
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H2O |
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850ul |
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1.2 GUS定性染色步骤
a)于预冷固定液(4%多聚甲醛溶液，新鲜制备)固定样本30min,偶尔摇晃或置于低速摇床上固定;
b)使用预冷的1 x磷酸盐或柠檬酸盐酸溶液清洗固定样本30-60min,中间更换几次清洗液;
c)真空渗透法将X-Gluc染色液加入待染色样本 [对于组织培养的拟南芥不需用真空渗透; ]黑暗条件室温或者37°C孵育几小时或过夜,或者明显的蓝色沉淀出现(不超过24h) ;
d)去离子清洗染色样本;
e)对于绿色样本， 使用70%乙醇脱色直到叶绿体完全去除，然后转移到去离子水内清洗;对于种子或其他样本，参考文献An ImprovedClearing Method for GUS Assay inArabidopsis Endosperm and Seeds的替代方法;
f) 肉眼或显微镜下观察，白色背景上的蓝色小点即为GUS表达位点。
[备注] :可直接订购我司(MKbio) 提供的GUS染色试剂盒(组织化学法) , 经济实惠，使用方便,节省溶液配制的大量麻烦步骤。
2. GUS活性检测(荧光分析法,定量研究)
GUS催化荧光底物MUG 4-甲基伞型酮-beta-D-葡糖苷酸,将其水解为4-MU (4-甲基伞型酮)和β-D-葡萄糖醛酸。4-MU中的羟基解离后在365nm的光激发下产生455nm的荧光。此时用荧光分光光度计测定得到的是相对值,因此同时需要用标准物4-MU进行校准。
荧光定量分析GUS活性有两种基本方法: 1) 在一个时间点测定GUS酶作用产物的总荧光量， 需要设定空白对照，以消除内源荧光强度; 2)测定一段时间内GUS的动力学过程。在酶反应初始阶段，酶作用产物与时间呈线性关系，而内源性荧光物质的荧光量与时间无线性关系。由此可计算GUS酶活力。GUS酶活性通常以μg MU/min/mg蛋白质。有时也可以用样本的鲜重来表示。
2.1检测步骤[仅作参考，根据具体实验条件做适当调整]
a)取约100mg愈伤组织或一片新鲜叶盘于1.5m|离心管内,加入100u|萃取缓冲液(extraction buffer)内匀浆。可加入少量沙子或玻璃珠提高研磨效率。
萃取缓冲液(extraction buffer) 配方: 50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，10mM DTT, 1mM Na2EDTA, 0.1%十二烷基肌氨酸，0.1%Triton X-100
b) 4°C, 15.000rpm离心5min.收集上清转移到另一干净的1.5ml离心管， 冰上放置待用。
c)取50μl 上述萃取上清到0.5ml 37°C预热的反应缓冲液(Assay buffer) ;用移液枪吹匀或漩涡混匀。
反应缓冲液(Assay Buffer) :称取17.6mg MUG溶于50ml萃取缓冲液,此时即为1mM MUG反应液。4°C保存，2周稳定。
d)在某一时间段内(高GUS活性样本30min;或低GUS活性1h-过夜; )吸取100μl溶液到含900μl终止液(Stop Buffer)的1.5ml离心管内，做好标记。有可能采集3-4个时间点和过夜孵育的时间点荧光量。[用荧光分光光度计在激发波长365nm、 发射波长455nm下，狭缝10nm时测定不同时间点的荧光强度值。]
e)以荧光强度值对反应时间作曲线，求出单位时间的荧光强度变化。用单位时间的荧光强度变化除以参加反应的蛋白量,求出单位质量的蛋白单位时间的荧光强度变化。
注意事项：
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
本产品仅供科研使用，不可用于临床诊断应用或其他用途。
