DNA恒温快速扩增试剂盒（胶体金试纸条型）使用说明书

【产品名称】

DNA恒温快速扩增试剂盒（胶体金试纸条型）

【原理概述】

本试剂盒基于一种常温恒温核酸快速扩增技术：在常温恒温条件下，重组酶和引物形成蛋白/单链核苷酸的复合体Rec/ssDNA，在辅助蛋白和单链结合蛋白SSB的帮助下，侵入双链DNA模板，在侵入位点形成D-loop区域，并开始对DNA双链进行扫描；待找到与引物互补的目的区域后，复合体Rec/ssDNA解体的同时，聚合酶也结合到引物的3’末端，开始链的延伸。依赖nfo酶的作用，加入根据模版设计的特异的分子探针，使用胶体金技术（三明治夹心法）可以对最终结果进行检测。

【产品特点】

本试剂盒具有灵敏度高、特异性强、反应时间短（仅需12 mins）等优点，反应组分为干粉状态，操作简便，易于保存。

本试剂对设备要求低，金属浴、水浴锅等即可进行反应操作，无需购买PCR扩增仪等价格高昂的专属设备。

【引物设计】

建议使用长度在 30-35 bp的引物，引物过短会影响扩增速度和检测灵敏度；下游引物的5’端标记一个修饰基团（常用生物素）。引物设计避免形成二级结构而影响扩增；扩增子长度建议在150-300 bp，通常不超过500 bp。

【荧光探针设计】

在上下游引物中间，设计一段长度为46-52nt与目的片段互补的序列；5’端修饰一个抗原标记（根据使用试纸条选择，典型为FAM）; 在5’端和3’末端的中部位置标记一个dSpacer（四氢呋喃，THF），作为nfo的识别位点；3’末端标记一个修饰基团，例如胺基、磷酸基团或C3-Spacer等。

【试剂盒组成】

【试剂盒储存】

【操作步骤】

1.提前30分钟将试剂盒所需组分取出，室温融化，震荡混匀。

2.每个干粉反应管加入10 μL A buffer（注意：A buffer需完全融化混匀，否则会对实验效果产生影响）；

3.每个反应管分别加入1 μL上游引物、1 μL下游引物和0.4 μL探针（引物和探针浓度为10 μM，对于多个反应、步骤2和步骤3可以混合后再分装至反应管中）；

4.向反应管中依次加入3.6 μL ddH2O和2 μL核酸模板（可根据核酸浓度调整加入的核酸模板体积，并相应调整加入的ddH2O体积，至模板与ddH2O总体积为5.6 μL）；

5.最后向反应管中加入2 μL B buffer并充分混合（对于多个反应，建议将B buffer加至反应管的盖子内侧，上下颠倒反应管8-10次混匀）；

6.混匀后，将反应液甩（或快速离心）至管子底部，然后立即将反应管放入恒温设备中37-39 ºC孵育8-12 mins；

7. 反应结束后，取10 μL加入含有190 μL ddH2O的离心管中，混合均匀后，将胶体金试纸条的样品端插入离心管中平衡，5 mins内观察质控线与检测线判读结果。

体系配制

【注意事项】

1. 由于试剂盒灵敏度非常高，在进行反应时请注意避免微量核酸污染，并尽量考虑设置空白对照以确认是否有核酸污染。

2. 试剂盒保质期12个月。每次使用时，请取出实验所需的MIRA反应单元的数量，置于冰浴条件下并在8小时内使用；剩余部分，请置于存储条件下。

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