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产品说明：

活花菁类染料（Cyanine Dyes）是一种在两个氮原子间含聚亚甲基桥键且携带一非定域电荷的分子【见下图】。

归其结构特征，花菁素具有极其高的消光系数通常高于100,000 L⋅mol-1⋅cm-1。不同的替代基允许控制发光团的性能比如吸光波长，光稳定性和荧光强度。例如，通过选择不同长度的聚亚甲基桥键能够控制吸光和荧光波长：花菁素越长，吸光和发射波长更高，高达至近红外区。

在生命科学领域广受欢迎的花菁类染料由美国卡耐基梅隆大学（CMU）的Alan Waggoner教授和同事于二十世纪90年代早期研发应用。这些染料呈现出低的生物分子非特异性结合，并由其巨大的消光系数和良好的量子产量产生明亮的荧光。目前商业化可提供各种反应性衍生物，比如点击化学用的N-羟基琥珀酰亚胺酯，马来酰亚胺，叠氮化物和其他衍生物。目前花菁染料常以两种异构体的形式供应：一种非磺化的花菁类染料和磺化的花菁类染料，对于许多应用，两种是可以互相替换的，因其光谱属性基本相同。两种染料都可用于DNA和蛋白质等生物分子的标记。两者的区别在于溶解度：磺化染料具水溶性，可以在水环境中标记，无需有机共溶剂，且在水中不易聚集。 

Sulfo-Cyanine5.5是一种水溶性，远红外发射的荧光团。因含4个磺基，该染料在中性pH中带负电荷，且有非常高的亲水性。

Sulfo-Cyanine5.5 NHS Ester (Sulfo-Cyanine5.5 SE)是Sulfo-Cyanine5.5的氨基反应活化酯。特别适合用于要求纯水溶性环境或无任何有机溶剂反应体内的抗体、敏感蛋白和其他物质的荧光标记。标记后的分子适用于小动物活体成像研究。

使用方法：

储【注意】：Cy染料和生物分子的比例（F/P）=4~12之间荧光强度最高。F/P过高，荧光探针会自我淬灭并且影响生物分子的活性。CyDye NHS在pH 8.5~9.4内标记抗体10min，F/P可达5~6。但在pH 7.0内几乎无反应。我司（懋康生物）内部使用Cy3 NHS标记Anti-GST抗体发现按1:1，1:5，1:10，和1:20标记得到的F/P分别为0.28:1，1.16:1，2.3:1和4.6:1。

一、 水溶性Cy3 NHS标记Anti-GST抗体【其它CyDye NHS参考此方法进行并做适当摸索】

商业化购买的抗体如果含有其他蛋白（如血清白蛋白，明胶等），或溶于带氨基的缓冲液，会影响标记。需在标记前对抗体进行纯化。

1. 于1L 0.15M NaCl溶液中透析Anti-GST（0.5ml，3mg/ml），室温或4℃透析4h。

2. 换用1L 新鲜的0.15M NaCl溶液，4℃透析过夜。

3.  第二天再换用1L 0.1M NaHCO3（pH 8.3），4℃透析4h。

4.    【可选】用0.22μm低吸附滤膜过滤透析后的抗体溶液。

5.  用0.1M NaHCO3（pH 8.3）稀释少量的抗体，于280nm测其紫外吸收值并计算标记抗体的总量（IgG抗体摩尔吸光系数为170,000 at 280nm）。

6.  用DMSO配制Cy3 NHS（Mw:765.95），浓度为10mg/ml。根据CyDye NHS和抗体的使用比值（比如1:20）来计算所需要染料的体积。然后慢慢将其加入到抗体溶液中，同时于暗处低速搅拌，室温45min。

7.  用1L 0.15M NaCl溶液，常温或4℃避光透析4h，以除去未标记上的Cy3 NHS。

8.  换用新鲜的1L 0.15M NaCl溶液，4℃避光透析过夜。

9.  换用1L 0.01M PBS/0.01% NaN3溶液室温或4℃避光透析4h，然后在4℃避光再次透析过夜。

10. 【可选】用0.22μm低吸附滤膜过滤透析后的抗体溶液。

11. 用0.01M PBS/0.01% NaN3溶液整数倍稀释标记抗体，测定280nm（蛋白）和552nm（Cy3）处的紫外可见吸光度。

12.  产品冷冻干燥成粉末或置于0.01M PBS/0.01% NaN3溶液中，-20℃避光保存。

【F/P计算】：

Cy3在552nm下的摩尔吸光系数为150,000 L⋅mol-1⋅cm-1，此蛋白在280nm的摩尔吸光系数为170,000 L⋅mol-1⋅cm-1，不同蛋白的摩尔吸光系数不同。Cy3本身在280nm处的吸收是552nm处的8%。按照以下公式计算F/P值。

[Cy3] = A552/150000; [Antibody] = [A280-(0.08×A552)]/170000

F/Pfinal= [Cy3]/ [Antibody]= [1.13×A552]/ [A280-(0.08×A552)]

二、 水溶性Cy5 NHS标记（D-ser2）-Leu-Enkephalin【其它CyDye NHS参考此方法进行并做适当摸索】

1.  低温保存的Cy5 NHS置于室温回温至少20min。往1mg粉末内加入400μl 高品质无水DMSO充分溶解。同样，低温保存的玻璃瓶装的（D-ser2）-Leu-Enkephalin（YSGFLT，0.75mg）室温回温后加入400μl 高品质无水DMSO充分溶解。将400μl Cy5 NHS加入400μl 多肽内。【染料与多肽通常质量比1:1】。

2.  再加入15μl 三乙胺，常温避光搅拌反应混合物，过夜。【若多肽稳定性较弱，则于4℃反应过夜】。

3.  用HPLC纯度多肽。使用C18柱子（25cm×10mm），每次上样注入2×400μl，30min梯度洗脱从0.1% TFA水溶液到MeCN:H2O (0.1% TFA)=70：30，流速4ml/min。（对不同的多肽选择不同的合适HPLC梯度流动相）

4.  收集适当的色带峰，标记多肽的保留时间比未标记的多肽长。

5.  产品冷冻干燥成粉末或置于水溶液中，-20℃避光保存。必要时可用质谱表征。

6.  CyDye标记的蛋白/多肽稳定性取决于蛋白本身。例如标记的IgG在4℃可避光保存2月，更长保存需加入等体积甘油-20℃避光保存。

【F/P计算】：

Cy5在650nm下的摩尔吸光系数为250,000 L⋅mol-1⋅cm-1，此蛋白在280nm的摩尔吸光系数为170,000 L⋅mol-1⋅cm-1，不同蛋白的摩尔吸光系数不同。Cy5本身在280nm处的吸收是650nm处的5%。按照以下公式计算F/P值。

[Cy5] = A650/250000; [Peptide] = [A280-(0.05×A650)]/170000

F/Pfinal= [Cy5]/ [Peptide]= [0.68×A650]/ [A280-(0.05×A650)] 

注意事项：

1.Sulfo-Cyanine5.5 NHS Ester水溶液的稳定性很弱，建议现配现用。Sulfo-Cyanine5.5 NHS Ester DMSO溶液的稳定性相对高，建议置于-20℃避光保存，1个月内稳定。

2.Sulfo-Cyanine5.5 NHS Ester具水溶性，除非标记实验严格要求纯水溶性环境，建议用DMSO溶解配制成母液后使用。一般情况下，Cy系列染料在含有机溶剂体系内的标记效率相对高些。

3.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

本产品仅供科研使用，不可用于临床诊断应用或其他用途。