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Jackson手把手教你如何选择合适的二抗
发布时间: 2020-4-17 14:08:35

什么是二抗?

二抗是在其它宿主体内制备的能与一抗或一抗片段结合的抗体,上面通常连有酶或荧光素等标签。由于二抗所具备的优点使得其在免疫学实验中得以应用广泛,如western blot(通过与特异性抗体结合来鉴定蛋白质),ELISA(以耦联有酶的抗体或抗原为标记来检测特异性的蛋白质,尤其是相应的抗原或抗体),免疫组织化学(检测组织中的特异性抗原),免疫细胞化学(通过免疫学方法检测细胞的抗原组成),流式细胞术(通过检测激光所激发荧光来鉴定分离不同类型的细胞)及免疫沉淀(通过抗原与抗体的特异性结合作用来分离相应抗原)。

使用二抗的优势?

二抗针对某一特定物种(如小鼠)的所有抗体均具有特异性,因而使用标记的二抗可以免去对每一个一抗进行标记,大大节省了时间和费用;此外,一个一抗分子可以同时结合几个二抗分子,从而使信号大大增强,提高了实验灵敏度。二抗可以耦联有几种不同的标记,可以是酶,荧光素,或生物素。

如何选择二抗?

检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择,同时在后继试验中也会有不同的检测方案,因此在选择二抗的时候要综合考虑一抗的类型及后继检测方案的要求,其中如何根据一抗的种属来源和类型选择二抗尤为重要。小编根据以往的经验整理了一下选择的要点:

1. 一抗的种属来源

二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源,例如:如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体,二抗则选抗小鼠的二抗(山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可);如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体,则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。即根据一抗的物种来源选择相应的抗该物种的二抗。

2. 一抗是属于哪个类或亚类

除了要与一抗的种属来源相一致,二抗还需与一抗的类别或亚类相匹配,这通常是针对单克隆抗体而言。一般来说多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白,因此相应的二抗就是抗IgG抗体。而单克隆抗体则相对复杂些,由于单克隆抗体有不同的类别和亚型,因此相应的二抗也需要根据这些亚型进行选择。

单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品说明书中都会有描述,如果您的一抗是小鼠IgM,那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgG抗体。如果单克隆一抗是小鼠 IgG的某一亚类(IgG1IgG2aIgG2bIgG3),那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合,或者您也可以选择专门针对这一亚类的二抗,例如,如果您的一抗是小鼠IgG1,那么您可以选择抗IgG1的二抗,此种抗体在双标记实验中尤其适合。在不清楚一抗为何种类/亚类的情况下,可以选用抗相应物种IgG,因为此种抗体可以识别大多数类型的IgG免疫球蛋白。

3. 二抗的种属来源

一般来说,不同的种属来源与二抗的质量没有必然的联系,来源于山羊的二抗与来源于驴的二抗在一般的实验里没有太多的差别。然而在一些特殊的实验里,如双标实验里,如果其中一个一抗是山羊来源的,一个是小鼠来源的,则相应的二抗分别要抗山羊和抗小鼠的二抗,这时候,二抗就不能选择山羊或者小鼠来源的。选择相应的驴来源的二抗,就非常适合做类似双标的免疫实验。双标得2个都抗才行,故选择第3个种源的抗体

4. 选择哪种形式的二抗,是整个IgG分子,F(ab')2片段,还是Fab片段?

整个IgG分子:此种抗体适用于多数情况。

F(ab')2片段:该种抗体是由两个靠二硫键连接的用于结合抗原的Fab片段组成, 这些抗体用在特定的情况中,如需要避免抗体与具有Fc受体的细胞结合的情况。

Fab片段:它们只有一个结合位点,一般用来封闭内源性免疫球蛋白。

5. 二抗的耦联标记

 一般来讲,耦联到二抗上的探针主要有酶,荧光基团(FITC, RRX, TR, PE)和生物素。选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。对于western blotELISA,最常用的二抗是酶标二抗,而细胞或组织标记实验(细胞免疫化学,组织免疫化学,流式细胞术)中通常使用荧光基团标记的二抗,免疫组化中也可以使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记的二抗。如果想要更大程度的放大检测信号,可以使用biotin/avidin检测系统。在一些荧光检测方案中,则需要选择不同的荧光标记;而金颗粒标记的二抗则更多的应用于免疫电镜中。

6. 抗体的纯度

亲和层析纯化的抗体一般更受人们欢迎,因为这些产品的纯度最高,产生的非特异性背景最少。但是有些情况下也要考虑到纯化过程中损失的IgG部分,因为其中含有亲和力很高的抗体,尤其是当目的抗原存在的量很小的时候,高亲和性的IgG部分就显得尤为重要。

下面总结了几种具有不同特异性的二抗

1)针对整个抗体分子(HL)具有特异性:

anti-IgG(H+L),此类抗体既可以与抗体的重链结合也可以与轻链结合,即与抗体分子的FcF(ab')2/Fab部分均可反应,anti- IgG(H+L)也可以与其他免疫球蛋白家族反应(如IgMIgA),因为所有的免疫球蛋白都具有相同的轻链(κ链或λ链)。

2)针对Fab片段具有特异性:

这类抗体与重链轻链均可以结合,由于它们可以与轻链反应,它们同时也可以和具有相同轻链的其他种类的免疫球蛋白反应。

3)针对Fc片段或重链具有特异性:

这类抗体和重链的Fc部分反应,因此它们是类别特异性的。即gamma链特异性抗体只与IgG反应,mu链特异性抗体只识别IgM,依此类推。

4)轻链(lambdakappa)特异性:

与所有类别的抗体反应,因为所有类别的抗体均具有相同的lambda链或kappa链。

5)经过吸附处理的二抗:

不同来源的免疫球蛋白含有相似的结构,抗一个物种的抗体可能与其他物种发生交叉反应,因此有些二抗经过了动物或人类IgG吸附处理,以减少非特异性背景。 例如,如果是小鼠的组织或细胞,那么选择经小鼠血清或IgG吸附处理过的二抗可以减少非特异性结合。但是此种抗体识别表位的数量被大大减少。


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